一、 全基因组甲基化测序概述 

全基因组甲基化测序结合了亚硫酸氢盐转化（bisulfite conversion）方法与新一代高通量测序技术，可在单碱基分辨率水平上高效地检测全基因组DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对 PCR产物进行高通量测序，与参考序列比对，即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。

二、 全基因组甲基化测序研究内容

全基因组甲基化图谱（DNA methylation profiling）及单样品高低甲基化位点在基因组不同区域的分布：全基因组甲基化测序可全面、精确地检测全基因组DNA甲基化状态，为更深入的表观遗传调控分析奠定基础。在全基因组甲基化图谱的基础上，对基因组不同染色体、不同基因区域、不同序列环境、不同基因功能元件如启动子、外显子、内含子、UTR区的胞嘧啶甲基化状态进行分析，有助于从多个角度研究基因的功能及调控。

研究流程示例

多样品间的差异性甲基化区域（DMR）分析：全基因组甲基化测序不但可使研究者在基因组规模洞察不同生物之间在DNA 甲基化水平和模式上的差异, 也可用于研究同一物种多个样品间的差异性甲基化区域（differentially methylated regions DMRs）。

基因组的甲基化状态具有一定的时空特异性。对某一物种，不同的环境、不同的发育阶段、不同类型的样品（细胞、组织、个体）所反映的甲基化状态可能是不同的，存在着差异性甲基化区域。其中有些是与基因调控有关的功能区域。鉴定、分析这些区域及其所在的基因或CpG岛，对发育和肿瘤等生命过程研究有一定意义。

研究流程示例

三、 全基因组甲基化测序实验技术路线

全基因组甲基化测序实验流程

四、 全基因组甲基化测序样品要求（基因组DNA）

样品纯度：OD 260/280值应在1.8～2.0 之间； RNA 应去除干净；
样品浓度：最低浓度不低于50ng/µl；
样品总量：每个样品总量不少于15µg；
样品溶剂：应溶解在H20或TE (pH 8.0)中；
样品运输：DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

五、全基因组甲基化测序数据分析技术路线

六、全基因组甲基化测序数据分析内容

1. 测序数据质量控制
包括：总reads数、总base数，Q20比例、Q20位点分布图、碱基分布图。

2. 测序数据预处理
包括：去除总体质量偏低的reads，将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端质量Q低于20的碱基；去除reads中所含有的接头序列；去除长度小于20的测序片段(reads)，去除含有低质量N碱基的reads。

3. 转化效率评估
使用lamda噬菌体基因组作为内参，评价BS转化效率。

4. 全基因组比对和mapping率统计

使用bismark软件将预处理后的reads比对到基因组，统计mapping率、样本整体甲基化水平，每个CpG\CHG\CHH位点的测序深度和甲基化比例。

5. CpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系

6. CpG/CHG/CHH位点覆盖率、测序深度、甲基化比例和染色体分布

1) CpG/CHG/CHH位点测序深度

2) CpG/CHG/CHH位点甲基化比例

3) CpG/CHG/CHH位点染色体分布

4) 高甲基化位点（甲基化比例>70%）和低甲基化位点（甲基化比例<30%）的基因功能区分布。

5) 甲基化程度（%）对于基因的不同功能区域的分布。

6) 甲基化程度（%）对于基因本体和上下游区域的分布。

7) 甲基化程度（%）对于CpG island,shore和shelf区域的分布。

7. 差异甲基化位点和区段筛选

使用fisher检验筛选差异甲基化CpG/CHG/CHH位点和甲基化区段。

8. 基因promoter、TSS、gene body区域甲基化水平计算和筛选

根据已有基因注释，计算基因的promoter、TSS、gene body等区域的甲基化情况，并据此筛选差异甲基化的基因。

9. 差异甲基化位点或区段的CpG岛注释和基因注释

1) 差异甲基化位点或区段CpG岛分布

2) 差异甲基化位点或区段不同基因功能元件分布

3) 差异甲基化位点或区段染色体分布

10. 全基因组甲基化图谱

11. 甲基化和表达谱数据的联合分析

将甲基化数据和表达谱数据结合分析，将基因的差异甲基化和差异表达进行关联，可进行差异基因的甲基化情况聚类热图、不同基因区域甲基化和表达谱相关性计算和作图。

12. GO和KEGG等功能分析和作图

13. 客户定制分析

可根据客户的研究需求，协商定制个性化分析内容

甲基化测序应用案例

• 全基因组甲基化测序揭示蚕基因组稀疏的甲基化

昆虫的表观遗传学调控可以反映其多样的生物反应过程，本研究采用Illumina高通量亚硫酸盐测序，检测了模式生物蚕在单碱基水平的甲基化情况。保守估计，基因组中0.11%的胞嘧啶被甲基化，且可能全部存在于CG二核苷酸中。基因区域CG甲基化是非常丰富的，这可能与基因表达水平相关，同时也暗示了甲基化在基因转录中扮演了一个正面的角色。研究人员发现转录元素、启动子及核糖体DNAs低甲基化，相反，基因区域与基因座匹配的小RNAs被充分甲基化。该研究有助于我们对于昆虫表观遗传的理解。

原文：Single base–resolution methylome of the silkworm reveals a sparse epigenomic map. Nature Biotechnology.2010,28:216-20.

单位介绍

•        上海伯豪生物技术有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心根据国内外研发外包发展的需要，整合旗下系统技术平台、商业化服务体系、高素质服务团队等资源成立的致力于研发外包服务的专业化公司。

  上海伯豪生物技术有限公司拥有六大服务平台：生物样品分析平台、微阵列芯片平台、新一代测序平台、生物标志物平台、分子检测平台、生物信息平台，凭借高标准的技术平台和多样化的服务等竞争优势，公司向国内外企业和相关单位提供系统的生物学研究全面解决方案。目前正在为多达18家跨国制药企业（包括排名前10位的跨国制药企业）和超过3000家的国内科研机构、医院等提供基因表达谱、基因分型、比较基因组学、DNA甲基化、miRNA、生物标志物筛选及确认、生物信息等技术服务。 

  公司拥有一支以上海为基础，辐射全国的强大市场营销队伍和销售网络，已设立华北、华南、华东三个大区十五个办事处，推广公司的主导技术服务、代理产品，快速提升公司品牌的知名度，扩大影响力。过去10年承接项目数超过10000个，用户单位3000家以上，协助客户发表SCI论文700余篇（影响因子共计3000多分），全面推动了中国基因组学服务产业的发展。 

  公司建立了规模化的质量控制体系，通过了ISO9001: 2008质量技术体系的认证，并参照GLP-L的标准，通过128个SOP文件对项目、样品、实验过程、生物信息分析过程、数据信息管理、保密等进行严格质控。尤其是数据管理，做到异地备份，保密管理。为用户的数据真实性、可靠性提供了保证。

  公司的系统化技术平台和高质量的服务体系得到了广大客户认可和合作伙伴的高度评价。公司平台陆续获得了国际知名高通量技术厂商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技术服务中心认证。公司于2012年获得诺华（CNIBR）优秀供应商奖（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中国第一家认证的服务提供商，是Agilent公司在国内唯一认证的服务提供商，先后被授予“Agilent公司亚太区最佳服务供应商”和“Affymetrix公司优秀服务商”称号。

  
  

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