DNA的甲基化修饰是表观遗传研究中的一个热点，在基因调控过程中扮演着重要的角色。它在维持组织特异性表达谱，使细胞获得并保持特定状态中起着重要作用。同时也调控着染色质稳定性、印迹基因表达调控、X染色体失活及抑制病毒和外源基因的表达等生物过程。更重要的是，在许多复杂疾病或生命过程的发生、发展中，也与DNA甲基化对基因的表达调控密切相关，这些疾病包括：癌症、神经系统紊乱、老化以及发育。

Illumina在原450K芯片巨大成功的基础上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代称），为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。850K芯片可检测人全基因组约853,307个CpG位点的甲基化状态，其中包含了原450K芯片91%的位点，并增加了413,745个位点（图 1）。850K芯片不但保持了对CpG岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区（新增了333,265个探针覆盖来自ENCODE及FANTOM5计划的增强子）以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。

芯片特点

• 覆盖全面：检测853,307个CpG位点；全面覆盖CpG岛、启动子、编码区及增强子。
• 无需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亚硫酸氢盐处理基因组DNA即可进行芯片实验； Infinium探针设计，直接识别甲基化位点；
• 技术重复重现率>98%；
• 操作简单，无须PCR扩增；模板量可低至250ng；
• 适用于FFPE样品。

图 1 Illumina Infinium MethylationEPIC (850K)芯片与450K芯片的异同

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片对全基因组的全覆盖

850K芯片对基因组的功能元件提供了空前全面覆盖：CpG岛、RefSeq基因、ENCODE开放染色质、ENCODE转录因子结合区以及FANTOM5增强子。领先的Infinium HD技术的保证了目标区域超高密度覆盖，同时还避免了甲基化DNA捕获方法具有偏向性的缺点。850K芯片的一大特点是增加了很多由ENCODE项目中鉴定出来的潜在增强子。（ENCODE通过全面分析开放染色质、FAIRE实验、转录因子结合区域，整合出基因组中最活跃的区域。）最后，芯片还覆盖了FANTOM5项目鉴定得到的不同组织类型中的增强子。下图及表格统计展示了850K芯片对于不同染色体、基因组功能元件的覆盖及分布。以上的设计不但可从泛-增强子及编码区域角度分析甲基化组，还在全基因组表观遗传关联研究（EWAS）中发挥重要作用。850K芯片中所包含的系列有价值的位点：

• CpG岛以外的CpG位点
• 人类肝细胞中的非CpG甲基化位点（CHH位点）
• 肿瘤（多种类型的癌症）VS正常样本中的不同甲基化位点，可以检测多种样本类型
• FANTOM5增强子
• ENCODE开放染色质和增强子
• 脱氧核糖核酸酶超敏位点
• miRNA启动子区域
• 涵盖Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的内容

图 2 850K芯片探针在不同染色体及基因组功能元件中的分布。

芯片数据的可靠性

Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探针设计（Figure 4）,以达到保证数据稳定可靠的同时也达到对目标区域全面覆盖。Infinium II探针对目的CpG位点采用单个探针且序列中包含简并碱基设计，即使序列中有多达三个CpG位点的甲基化状态影响也不会对目的位点的结果造成影响。Illumina的科学家严格检测每个产品，以确保强大而重复的性能，让研究人员能够实现行业领先的数据质量。

（1）Infinium Ⅰ 探针设计

在InfiniumI设计中对于每个甲基化位点，都对应设计有两种探针：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为G，用来检测甲基化位点（C）。U型磁珠尾部为A，用来检测未甲基化位点(T)。根据单碱基延伸的原理，仅当探针最后一个碱基与模板配对时，荧光标记的核苷酸才能掺入并被检测到荧光信号。通过分析M型与U型磁珠荧光信号的结果计算甲基化值。

（2）Infinium Ⅱ 探针设计

Infinium Ⅱ 探针只使用一种磁珠，探针末端为C，与目的位点的前一个碱基配对，只延伸一个碱基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分别与非甲基化或甲基化位点配对。根据两种荧光类型及计算目的位点的甲基化程度。

基于Infinium平台的可靠性，850K芯片表现出非常完美的重复相关系数（r2＞0.98），而且850K芯片与450K芯片相同的位点的重复r2＞0.98，为850K与450K数据的整合分析建立了基础。此外通过比较8个生物学样品的重复的结果，850K芯片能可靠检测0.2的delta-beta值，且假阳性率低于1%。此外，芯片中设计了样品依赖和样品不依赖的内参以保证数据的高质量，例如专为亚硫酸氢盐转化后而复杂度降低序列而设计的阴性对照。

图 3 EPIC芯片自身技术重复间的相关性以及与450K相同探针间的相关性R方都在0.98以上。

850K芯片适用于FFPE样品的甲基化研究

 Illumina为FFPE样本的检测改进了protocol，以获得更可靠成稳定的结果。通过与新鲜样本的比较，可见虽然FFPE样本的检出率受到样本质量的影响而下降，但FFPE样本的技术重复的相关性R平方仍然高达0.98。对同一份样本的冰冻样本及FFPE样本的结果比较发现两者相关依然很高（R=0.994）。

图 4 850K芯片用于FFPE样本时的技术重复相关性（R2>0.98）及检出率(>90%)；相同标本分别用FFPE处理与冰冻效果相比，重复相关性（R=0.994）。 

样本要求

样品类型：组织、细胞、基因组DNA

• 样品纯度：OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染。
• 样品浓度：浓度不低于50ng/μl；
• 样品总量：每个样品总量不少于2μg 。
• 样品溶剂：溶解在TE中。
• 样品运输： DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

数据分析

 详细内容同450K数据分析内容，

详见链接：http://www.shbio.cn/product/30.html

单位介绍

•        上海伯豪生物技术有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心根据国内外研发外包发展的需要，整合旗下系统技术平台、商业化服务体系、高素质服务团队等资源成立的致力于研发外包服务的专业化公司。

  上海伯豪生物技术有限公司拥有六大服务平台：生物样品分析平台、微阵列芯片平台、新一代测序平台、生物标志物平台、分子检测平台、生物信息平台，凭借高标准的技术平台和多样化的服务等竞争优势，公司向国内外企业和相关单位提供系统的生物学研究全面解决方案。目前正在为多达18家跨国制药企业（包括排名前10位的跨国制药企业）和超过3000家的国内科研机构、医院等提供基因表达谱、基因分型、比较基因组学、DNA甲基化、miRNA、生物标志物筛选及确认、生物信息等技术服务。 

  公司拥有一支以上海为基础，辐射全国的强大市场营销队伍和销售网络，已设立华北、华南、华东三个大区十五个办事处，推广公司的主导技术服务、代理产品，快速提升公司品牌的知名度，扩大影响力。过去10年承接项目数超过10000个，用户单位3000家以上，协助客户发表SCI论文700余篇（影响因子共计3000多分），全面推动了中国基因组学服务产业的发展。 

  公司建立了规模化的质量控制体系，通过了ISO9001: 2008质量技术体系的认证，并参照GLP-L的标准，通过128个SOP文件对项目、样品、实验过程、生物信息分析过程、数据信息管理、保密等进行严格质控。尤其是数据管理，做到异地备份，保密管理。为用户的数据真实性、可靠性提供了保证。

  公司的系统化技术平台和高质量的服务体系得到了广大客户认可和合作伙伴的高度评价。公司平台陆续获得了国际知名高通量技术厂商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技术服务中心认证。公司于2012年获得诺华（CNIBR）优秀供应商奖（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中国第一家认证的服务提供商，是Agilent公司在国内唯一认证的服务提供商，先后被授予“Agilent公司亚太区最佳服务供应商”和“Affymetrix公司优秀服务商”称号。

  
  

单位资质

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